فراوانی، شناسایی و جداسازی آنتامبا هیستولیتیکا از آنتامبا دیسپار درنمونه های مدفوعی با روش پارازیتولوژی و مولکولی در مرکز درمانی میاندوآب 91 - 90

Abstract

Introduction: E.histolytica, a pathogenic amoeba, is impossible to differentiate in its cyst and trophozoite stages from E.dispar, non-pathogenic amoeba, by light microscopy. Therefore we have performed a nested multiplex PCR targeting small subunit rRNA gene for differential detection of all the two morphologically similar forms of E.histolytica and E.dispar simultaneously in stool samples. Materials and methods: All fecal samples were screened for amebic cells by microscopic examination. Samples collected in bottles without preservation were concentrated using a formalin-ether sedimentation technique for identification of cysts and trophozoites .Fecal samples containing amebic cells were stored at -20C until DNA extraction was performed. Entamoeba cells were subjected to DNA extraction using a commercial genomic DNA extraction kit. The genus specific primers were designed using nucleotide sequences of 18S- rRNA gene of Entamoeba. The PCR amplicons were separated electrophoretically in 1% agarose gel stained with ethidium bromide. The gels were visualized by UV light and photographed. Results: A total of 31 out of 724 stool samples displayed were positive for Entamobahistolitica / Entamobadispar by microscopy. The nested multiplex PCR expanded and assessed in this study illustrated that the size of diagnostic fragments of PCR products was obviously different for all the two Entamoba species, the species-specific product size for E.histolytica and E.dispar was 439 and 174 bp respectively. The species-specific nested Multiplex PCR was positive in 26 out of 31 stool specimens that were positive 18 samples for E.dispar and 8 samples for E.histolytica., انتامبا هیستولیتیکا ، آمیب بیماریزا، از انتامبا دیسپار ،آمیب غیربیماریزا، در اشکال تروفوزوئیت و کیست به وسیله میکروسکوپ نوری قابل جداسازی از هم نیستند . این در حالیست که انتامبا هیستولیتیکا نیاز به درمان دارویی دارد ولی درمان دارویی در آلودگی با انتامبا دیسپار توصیه نمی گردد. بنابراین برای شناسایی و جداسازی این دو گونه کاملا مشابه از نظر مورفولوژیکی در نمونه های مدفوعی از روش nested multiplex PCR بر اساس ژن SSU-rRNA استفاده نمودیم .روش کار و مواد : نمونه ها ابتدا به روش مستقیم میکروسکوپی با سرم فیزیولوژی و محلول لوگل بررسی گردیده سپس با استفاده از روش تغلیظ رسوب فرمالین اتیل استات از لحاظ وجود آمیب هیستولیتیکا/دیسپار بررسی گردیدند. نمونه های مثبت اعم از تروفوزوئیت یا کیست آنتامبا هیستولیتیکا/دیسپار در الکل 70 درجه در منهای 20 درجه سلسیوس تا زمان استخراج DNA نگهداری گردیدند. استخراج DNA با استفاده از کیت های تجاری استخراج DNA و طبق دستور سازنده کیت انجام گردید . نمونه های DNA تا زمان انجام PCR در منهای 20 درجه نگهداری گردید. برای PCR در مرحله اول از جفت پرایمرهای اختصاصی جنس انتامبا هیستولیتیکا/دیسپار ودر مرحله دوم از جفت پرایمرهای اختصاصی گونه با استفاده از ژن 18srRNA برای هر یک از آمیب ها وافتراق دو گونه استفاده گردید . آمپلیکون های PCR در ژل آگارز الکتروفورز شده و با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی گردیده وبا استفاد دستگاه لومیناتور آشکار سازی گردیدند .یافته ها : بر اساس مطالعه میکروسکوپی از مجموع 724 نمونه مورد بررسی تعداد 31 نمونه به عنوان انتامبا هیستولیتیکا/انتامبا دیسپار جدا گردید . پرایمرهای اختصاصی جنس انتامبا ، آمپلیکون های 1.070 جفت بازی را تکثیر کردند که 26 نمونه از 31 نمونه تحت آزمایش را شامل میشد . پرایمرهای اختصاصی گونه ،آمپلیکون های به اندازه 439 و 174 جفت بازی را تکثیر نمودند که به ترتیب معرف انتامبا هیستولیتیکا و انتامبا دیسپار بودند ، که بطور آشکاری برای دو گونه متفاوت بود و از مجموع 31 نمونه تعداد 8 نمونه به عنوان انتامبا هیستولیتیکا و تعداد 18 نمونه به عنوان انتامبا دیسپار شناسایی گردید