بررسی تمایز سلولهای بنیادی هماتوپوئتیک CD34+ خون بند ناف به مگاکاریوسیت در محیط کشت نانوفیبر PES در مقایسه با محیط کشت 2 بعدی معمول

Abstract

Evaluation of human cord blood CD34+ hematopoietic stem cell expansion and their differentiation to megakaryocyte on aminated PES nanofiber scaffold compare to 2-D culture system. CD34 cells were positively enriched using MidiMACS system. Purified cell population counting was performed by a hemocytometer. The viability was determined by trypan blue exclusion dye and the CD34+ purity in enriched HSPC was determined by flow cytometry. CD34+ cell were seeded onto 2D conventional culture and aminated PES scaffold for 9 days. The expanded cells were harvested for cell counting on day 7 and for quantification of apoptosis on day 7 and 9. The harvested cells were then used for flow cytometry analysis, colony-forming cell (CFC) assay, the measurement of transcription factors expression levels specifically involved in megakaryocytopoiesis, as NF-E2 and GATA-1, detection of nuclear lobulation and apoptosis in conventional -2D and aminated PES culture on different days. This study indicated increased CD34+ cell population and decreased rate of apoptosis in aminated PES culture in comparison with 2-D culture system. After megakaryocytic differentiation, the amount of CD41 and CD61 expressing cells and quantity of NF-E2 expression level increased in aminated PES culture versus 2-D culture system. Quantity of GATA-1 expression level was reduced on CD41+ and CD61+ cells compared to CD34+ cell population with no difference between aminated PES and conventional system. There was no diversity in nuclear lobulation and apoptosis of CD41/61+ cells between two culture systems after megakaryocytic differentiation. , هدف از این مطا لعه، بررسی تاثیر نانوفیبر PES آمینه در تکثیر و تمایز سلولهای مگاکاریوسیتی مشتق شده از سلول های CD34+ خون بند ناف که در مقایسه با محیط کشت 2 بعدی معمول انجام می شود. سلول های CD34+ با روش جداسازی با ستون MidiMACS تخلیص شد. شمارش سلول های CD34 + با استفاده از لام نئوبار انجام گردید. جهت بررسی میزان قابلیت حیات سلولی از رنگ تریپان بلو استفاده شد. همچنین ارزیابی درصد خلوص سلول های CD34 + با روش فلوسایتومتری صورت گرفت. سلول های CD34 + جدا شده در محیط کشت دو بعدی و محیط نانوفیبر PES آمینه به مدت 9 روز کشت داده شدند. میزان تکثیر سلولی در روز هفتم و مرگ سلولی در روز هفتم و نهم تکثیر مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین توانایی تشکیل کلنی سلول های CD34 + ارزیابی شد. میزان سلول های بیان کننده آنتی ژن هایCD41 وCD61، میزان بیان ژن های اختصاصی رده مگاکاریوسیتی (GATA-1 و (NF-E2 ، میزان لوبولاسیون هسته و مرگ سلول ها، در روز های مختلف مرحله تمایز در هر دو محیط دو بعدی و محیط نانوفیبر PES آمینه انجام شد. نتایج بدست آمده نشان داد که میزان تکثیر سلول های CD34 +، میزان سلول های بیان کننده مارکر های CD41 و CD61 و میزان بیان ژن NF-E2 در محیط نانوفیبر PES آمینه در مقایسه با محیط دو بعدی معمول در روز های مختلف افزایش داشت. میزان مرگ سلول های CD34+ در محیط نانوفیبر PES آمینه نسبت به محیط دو بعدی کاهش نشان داد. در حالیکه میزان ژن GATA-1 در محیط دو بعدی و نانوفیبر PES آمینه نسبت به سلول های CD34 + روز صفرکاهش نشان داد اما در محیط دو بعدی معمول نسبت به محیط نانوفیبر PES آمینه تفاوتی مشاهده نشد. میزان لوبولاسیون هسته و مرگ سلول های در حال تمایز(CD41/61+ ) در محیط نانوفیبر PES آمینه نسبت به محیط دو بعدی نیز تفاوتی را نشان نداد.